BAB IV
UJI
KUALITATIF PROTEIN
TUJUAN :
- Mengetahui prinsip dasar uji kualitatif protein
- Mengetahui perbedaan prinsip dari masing-masing metode
A. Pre-lab
1. Bagaimana prinsip analisis protein dengan
metode ninhidrin?
Pada prinsip uji ninhidrin
ini, yaitu menguji ada tidaknya protein dalam suatu senyawa dengan penambahan
reagen ninhidrin untuk mengetahui jumlah kadar asam amino bebas yang
terkandung didalamnya, dimana asam amino bebas akan bereaksi dengan ninhidrin
dan membentuk senyawa kompleks berwarna ungu. Uji Ninhidrin dilakukan
dengan menambahkan beberapa tetes larutan ninhidrin yang kemudian dipanaskan.
Reaksi ini terjadi dengan senyawa amin primer dan ammonia tanpa pembebasan
CO. Adanya protein atau asam amino ditunjukkan dengan terbentuknya warna ungu
pada bahan uji (Kristiani, 2010).
|
2. Bagaimana
prinsip analisis protein dengan metode biuret?
Pada prinsip uji biuret,
yaitu menguji ada atau tidak adanya protein dalam suatu senyawa dengan
penambahan reagen NaOH dan CuSO4 berdasarkan ada atau tidaknya
ikatan peptida (ikatan peptida harus 2 atau lebih). Dimana ion Cu2+
(dari pereaksi biuret) dalam suasana basa akan bereaksi dengan polipeptida
yang menyusun protein dan membentuk senyawa kompleks berwarna biru hingga
ungu (Eades, 2010).
|
3. Mengapa pengujian protein selalu dilakukan pada
kondisi alkali/basa?
Pengujian protein dilakukan pada kondisi basa karena CuSO4
dalam suasan basa akan bereaksi dengan ikatan peptida yang kemudian dapat
membentuk senyawa kompleks berwarna ungu. Warna yang dihasilkan
tergantung tergantung panjang dari
ikatan peptida. Ikatan peptida yang panjang akan menghasilkan warna ungu dan
apabila semakin pendek ikatan warnanya akan memudar dan menjadi merah muda
(Lowery, 2012).
|
B. Tinjauan Pustaka
1. Protein
Protein
tersusun dari peptida-peptida sehingga membentuk suatu polimer yang disebut
polipeptida. Setiap monomernya tersusun atas asam amino. Peranan protein
diantaranya sebagai katalisator, pendukung, cadangan, sistem imun, dsb (Ngili,
2009).
Protein yang
tersusun dari rantai asam amino akan memiliki berbagai macam struktur yang khas
pada masing-masing protein. Adapun struktur protein meliputi struktur primer,
struktur sekunder, struktur tersier, dan struktur kuartener. Struktur primer merupakan struktur
yang urutan asam aminonya tersusun secara linear dan tidak terjadi percabangan
rantai. Struktur sekunder
merupakan kombinasi antara struktur primer yang linear dan memiliki
segmen-segmen dalam polipeptida yang terlilit. Struktur tersier dari suatu protein adalah lapisan yang tumpang
tindih di atas pola struktur sekunder yang terdiri atas pemutarbalikan tak
beraturan dari ikatan antara rantai samping (gugus R) berbagai asam amino Struktur kuarterner adalah protein
membentuk molekul kompleks, beberapa rantai protein bergabung membentuk seperti
bola (Lesk, 2013).
2. Uji Ninhidrin
Uji ninhidrin
adalah metode yang digunakan untuk menganalisa protein secara kualitatif. Uji
ninhidrin ini didasarkan pada reaksi yang terjadi antara asam amino dengan
ninhidrin. Asam amino akan bereaksi dengan ninhidrin membentuk aldehida dengan
1 atom C yang lebih rendah melepaskan molekul NH3 dan CO2.
Selain melepaskan NH3 dan CO2, asam amino yang bereaksi
dengan ninhidrin akan membentuk warna ungu atau biru. Warna yang dihasilkan
tersebut disebabkan karena molekul ninhidrin dan hidratin bereaksi dengan NH3
setelah asam amino tersebut dioksidasi (Darjanto, 2008).
Reaksi yang
terjadi yaitu:
(Kristianti,
2010).
3. Uji Biuret
Uji biuret
adalah metode yang digunakan dalam analisis protein secara kualitatif. Metode
biuret ini didasarkan pada reaksi antara ion Cu2+ dengan ikatan
peptide dalam suasana basa. Ion Cu2+ yang terdapat pada reagen
biuret akan bereaksi dengan polipeptida atau ikatan-ikatan peptide penyusun
protein dalam keadaan basa. Reaksi antara ion Cu2+ dengan ikatan-ikatan peptide tersebut
menghasilkan warna kompleks ungu. Warna ungu yang terbentuk tersebut disebabkan
karena ikatan-ikatan peptide protein tersebut melarutkan hidroksida tembaga.
Reaksi pembentukan warna ini dapat terjadi pada senyawa yang mengandung 2 gugus
karbonil yang berikatan dengan nitrogen atau atom karbon (Darjanto, 2008).
Reaksi yang
terjadi yaitu:
(Kristianti,
2010).
4. Fungsi Reagen
4.1 Reagen Ninhidrin
Ninhidrin adalah suatu reagen yang berguna untuk
mendeteksi asam amino dan menetapkan konsentrasinya dalam larutan. Apabila
bereaksi dengan asam amino menghasilkan zat berwarna ungu. Reagen ini dapat menyebabkan iritasi saluran pernafasan.
Berbahaya jika tertelan dan berbahaya
jika diserap melalui kulit atau terhirup (Hawab, 2006).
Struktur ninhidrin:
(Kristianti,
2010).
4.2 Reagen Biuret
Reagen biuret merupakan senyawa dengan rumus kimia
H2NC(O)NHC(O)NH2. Reagen biuret ini merupakan hasil kondensasi dari dua molekul
urea. Reagen biuret ini dapat menyebabkan iritasi jika terpapar pada daerah
sensitive pada jangka waktu lama. Reagen biuret digunakan untuk
mengidentifikasi adanya ikatan peptide pada suatu sampel yang diuji (Hawab,
2006).
Struktur reagen biuret:
(Kristianti,
2010).
5. Tinjauan Bahan
5.1 Gelatin
Gelatin adalah protein yang diperoleh dari jaringan
kolagen hewan. Pada umumnya diproduksi dari kulit dan tilang sapi atau babi.
Gelatin digunakan pada industri makanan, farmasi, obat-obatan dan lain
sebagainya (Lesk, 2013).
Struktur gelatin:
(Lowery,
2012).
5.2 Susu Skim
Susu skim adalah airan susu yg telah dipisahkan dari
kepala susu sehingga kadar lemak dan vitaminnya rendah (Lesk, 2013).
Struktur susu skim:
(Lowery, 2012).
5.3 MSG
MSG adalah asam glutamat yang diproduksi dari
fermentasi tetes tebu dan pati makanan. Banyak ahli berpendapat akumulasi MSG
selama bertahun-tahun bisa memicu berbagai penyakit termasuk obesitas,
alzheimer, dan penyakit kronis lainnya (Lowery, 2012).
Struktur MSG:
(Lowery, 2012).
5.4 Aspartam
Aspartame merupakan pemanis buatan yang mempunyai
kadar kemanisan 200 kali lebih manis daripada gula. Aspartam terdiri dari asam
amino yang tersusun dari fenilalanin dan
asam aspartat (Lowery, 2012).
Struktur aspartame:
(Lowery,
2012).C. Diagram Alir
1. Uji Ninhidrin
|
||||
 |
||||
|
 |
Dimasukkan
pada air mendidih selama 15- 20 detik
Diamati warna
larutan
Dicatat hasil
pengamatan
|
2. Uji Biuret
|
||||
 |
||||
|
 |
|
Dikocok
 |
Diamati
timbulnya warna
Dicatat hasil
pengamatan
|
C. Hasil Percobaan Dan Pengamatan :
1. Uji Ninhidrin
a. Tuliskan data
hasil uji Ninhidrin
No.
|
Sampel
|
Sebelum Pemanasan
|
Sesudah Pemanasan
|
Hasil uji
|
1
|
Susu Skim
|
Kuning keruh
|
Kuning keruh ada endapan ungu
muda
|
+
|
2
|
MSG
|
Ungu bening
|
Ungu pekat
|
+
|
3
|
Aspartam
|
Putih keruh
|
Terdapat endapat ungu
|
+
|
4
|
Gelatin
|
bening
|
Bening
|
-
|
b.
Bahas dan bandingkan
data-data hasil uji Ninhidrin dari beberapa sampel dalam percobaan ini!
Sebelum melakukan uji
Ninhidrin, hal pertama yang dilakukan yaitu menyiapkan alat dan bahan. Alat
yang disiapkan adalah tabung reaksi sebagai tempat uji sampel, rak tabung
reaksi sebagai tempat meletakkan tabung reaksi, kertas label untuk memberi nama
sampel pada tabung reaksi, pipet ukur untuk mengambil sampel dan gelas ukur
untuk mengukur volume sampel. Bahan yang digunakan yaitu reagen Ninhidrin,
larutan susu skim, MSG, aspartam dan gelatin.
Percobaan
pertama diawali dengan memasukkan sampel MSG dan aspartam ke dalam tabung
reaksi menggunakan pipet ukur sebanyak 2 ml. Untuk sampel susu skim dan gelatin
juga dimasukkan ke dalam tabung reaksi sebanyak 2 ml namun menggunakan gelas
ukur. Hal ini dikarenakan susu skim dan gelatin memiliki partikel yang lebih
besar sehingga akan sulit jika diambil dengan pipet ukur. Kemudian
masing-masing sampel ditambahkan Ninhidrin sebanyak 2 ml. Kemudian secara
bersamaan kelima sampel tersebut dimasukkan dalam gelas beker yang berisi air
mendidih selama 20 detik. Pemanasan bertujuan untuk mempercepat reaksi. Kemudian
secara bersamaan pula ke-lima sampel diangkat dari gelas beker. Selanjutnya diamati perubahan warna yang
terjadi pada kelima sampel tersebut.
Dari
percobaan yang telah dilakukan terdapat perubahan warna pada beberapa sampel
yang diuji. Pada sampel susu skim yang
semula berwarna kuning keruh setelah dipanaskan warnanya tetap namun terdapat
endapan ungu muda. Pada sampel MSG yang semula berwarna ungu bening setelah
dipanaskan warnannya berubah menjadi ungu pekat. Pada sampel aspartam yang
semula berwarna putih keruh setelah dipanaskan terdapat endapan ungu. Sedangkan
pada sampel gelatin tidak mengalami perubahan warna.
Pada
prinsip kerja uji ninhidrin ini, menguji ada atau tidaknya protein dalam suatu
senyawa dengan penambahan reagen ninhidrin untuk mengetahui jumlah kadar asam
amino bebas yang terkandung didalamnya, dimana asam amino bebas akan bereaksi
dengan ninhidrin dan membentuk senyawa kompleks berwarna ungu. Pada sampel susu
skim, MSG, dan aspartam terbentuk endapan atau warna ungu karena ketiga sampel
tersebut terdapat asam amino bebas. Urutan asam amino bebas terbanyak yaitu
MSG, aspartam dan susu skim. Karena dapat dilihat dari kepekatan warna ungu
yang dihasilkan. Sehingga hasil uji sampel susu skim, MSG dan aspartam yaitu
positif. Sedangkan pada gelatin tidak terjadi perubahan warna baik setelah
ditambah reagen ninhidrin maupun setelah dipanaskan. Hal ini dikarenakan
molekul gelatin sangat kompleks dibanding ketiga sampel lain sehingga kadar
asam amino bebasnya tidak ada atau hanya sedikit sekali. Sehingga hasil uji
sampel gelatin negatif. Hal ini sesuai dengan literatur bahwa semakin kompleks
suatu protein maka semakin sedikit asam amino bebas yang dimiliki (Pazos,
2015).
Reaksi yang terjadi pada uji
ninhidrin ini adalah :
Pada reaksi diatas ninhidrin
ditambah asam alfa amino akan bereaksi secara reduksi menghasilkan ninhidrin yang
tereduksi dan NH3, karbondioksida dan gugus aldehid. Kemudian ninhidrin yang tereduksi
dan NH3 akan bereaksi dengan ninhidrin lainnya dan diproses secara kondensasi
menghasilkan garam diketo-hydrihalide-diketo-hydramine yang menyebabkan warna
ungu (Purba, 2007).
2.
Uji Biuret
a. Tuliskan data hasil
uji Biuret
No.
|
Sampel
|
Sebelum ditambah reagen
|
Sesudah ditambah reagen
|
Hasil uji
|
1
|
Susu skim
|
Warna kuning tidak ada endapan
|
Ada 2 lapisan. Atas biru, bawah
ungu.
|
+
|
2
|
MSG
|
Bening
|
Ada lapisan biru
|
-
|
3
|
Gelatin
|
Bening
|
Atasnya berwarna ungu
|
+
|
4
|
Aspartam
|
Bening tidak ada endapan
|
Ada lapisan biru
|
-
|
b. Bahas dan bandingkan data-data
hasil uji Biuret dari beberapa sampel dalam percobaan ini!
Sebelum melakukan uji Biuret,
hal pertama yang dilakukan yaitu menyiapkan alat dan bahan. Alat yang disiapkan
adalah tabung reaksi sebagai tempat uji sampel, rak tabung reaksi sebagai
tempat meletakkan tabung reaksi, kertas label untuk memberi nama sampel pada tabung
reaksi, pipet ukur untuk mengambil sampel, pipet tetes untuk mengambil larutan
dan gelas ukur untuk mengukur volume sampel. Bahan yang digunakan yaitu reagen
Biuret, NaOH, larutan susu skim, MSG, aspartam dan gelatin.
Percobaan
pertama diawali dengan memasukkan sampel MSG dan aspartam ke dalam tabung
reaksi menggunakan pipet ukur sebanyak 3 ml. Untuk sampel susu skim dan gelatin
juga dimasukkan ke dalam tabung reaksi sebanyak 3 ml namun menggunakan gelas
ukur. Hal ini dikarenakan susu skim dan gelatin memiliki partikel yang lebih
besar sehingga akan sulit jika diambil dengan pipet ukur. Kemudian
masing-masing sampel ditambahkan NaOH sebanyak 1 ml. Penambahan NaOH ini
berujuan agar kondisi larutan menjadi basa sehingga mudah bereaksi dengan
reagen Biuret. Kemudian masing- masing tabung reaksi dikocok agar larutan
tercampur merata. Setelah itu ditambahkan reagen Biuret atau CuSO4
sebanyak 5 tetes menggunakan pipet tetes.
Selanjutnya diamati perubahan warna yang terjadi pada kelima sampel
tersebut.
Dari
percobaan yang telah dilakukan terdapat perubahan warna pada beberapa sampel
yang diuji. Pada sampel susu skim yang
semula berwarna kuning tidak ada endapan setelah ditambahkan reagen warnanya berubah
menjadi biru di bagian atas dan ungu di bagian bawah. Pada sampel MSG yang
semula berwarna bening setelah ditambahkan reagen terdapat lapisan biru. Pada
sampel aspartam yang semula berwarna bening tidak ada endapan setelah ditambahkan
reagen terdapat lapisan atas berwarna ungu. Sedangkan pada sampel gelatin setelah
ditambahkan reagen terdapat lapisan berwarna biru.
Pada
prinsip kerja uji biuret ini, menguji ada atau tidaknya protein dalam suatu
senyawa dengan penambahan NaOH dan CuSO4 berdasarkan ada tidaknya
ikatan peptida, dimana ion Cu2+ dari pereaksi biuret dalam suasana
basa akan bereaksi dengan polipeptida yang menyusun protein dan membentuk
senyawa kompleks berwarna ungu. Pada sampel susu skim, dan gelatin terbentuk lapisan
berwarna ungu karena kedua sampel termasuk senyawa kompleks sehingga memiliki ikatan
peptida yang panjang. Sehingga hasil uji sampel susu skim dan gelatin yaitu
positif. Sedangkan pada MSG dan aspartam terbentuk lapisan berwarna biru yang
menandakan ikatan peptidanya sangat pendek. Hal ini dikarenakan molekul MSg dan
aspartam tidak sekompleks susu skim dan gelatin sehingga ikatan peptidanya
hanya pendek sekali. Sehingga hasil uji sampel gelatin negatif. Hal ini sesuai
dengan literatur bahwa semakin kompleks suatu protein maka ikatan peptida yang
dimiliki juga semakin panjang (Buckle, 2007).
Reaksi yang terjadi pada uji
ninhidrin ini adalah :
Ikatan peptida akan bereaksi
dengan reagen biuret menghasilkan perubahan warna. Ion Cu2+ (dari
pereaksi biuret) dalam suasana basa akan bereaksi dengan NH dari ikatan peptida
dan O dari air membentuk senyawa kompleks berwarna biru hingga ungu (Sudaryani,
2006).
PERTANYAAN
1. Bagaimana
mengidentifikasi adanya gugus amino pada sampel dengan menggunakan uji
Ninhidrin?
Dengan memasukkan reagen ninhidrin pada sampel, karena asam amino akan
bereaksi dengan ninhidrin dan membentuk senyawa kompleks berwarna ungu.
Sehingga indikasi adanya asam amino ditunjukkan oleh perubahan warna sampel
pada saat sesudah direaksikan dan dipanaskan, yakni apabila ia mengandung asam
amino makan akan berwarna ungu. Namun ada juga yang tanpa dipanaskan sudah
menghasilkan warna ungu, misalnya MSG (Purba,
2007).
2.
Bagaimana reaksi yang terjadi antara sampel dengan
reagen pada uji Biuret?
Dalam uji biuret ini, sampel harus dalam
suasana basa agar polipeptida sampel dapat bereaksi dengan Cu2+ dari
biuret. Uji ini sendiri didasarkan pada reaksi pembentukan kompleks Cu2+ yang
dihasilkan oleh CuSO4, dengan gugus –CO dan –Na pada ikatan peptida
dalam larutan bersuasana basa dan menghasilkan senyawa kompleks berwarna biru
hingga ungu. Setelah direaksikan dengan sampel, warna yang terbentuk mudah
pudar, hal ini dikarenakan ion Cu2+ mengikat 2 ikatan peptida dan
jika lama dibiarkan ikatan tersebut semakin lemah (tidak stabil) sehingga itu
yang menyebabkan warnanya jika dibiarkan lama akan memudar (Sudaryani, 2006).
KESIMPULAN
Percobaan uji kualitatif protein bertujuan untuk mengetahui prinsip dasar
uji kualitatif protein dan mengetahui perbedaan prinsip dari masing-masing
metode. Prinsip dari uji ninhidrin adalah menguji ada atau tidaknya protein dalam suatu senyawa dengan penambahan
reagen ninhidrin untuk mengetahui jumlah kadar asam amino bebas yang terkandung
didalamnya, dimana asam amino bebas akan bereaksi dengan ninhidrin dan
membentuk senyawa kompleks berwarna ungu, dimana asam amino mereduksi
ninhidrin. Sedangkan prinsip dari uji biuret adalah menguji ada atau tidak
adanya protein dalam suatu senyawa dengan penambahan reagen NaOH dan CuSO4
berdasarkan ada atau tidaknya ikatan peptida (ikatan peptida harus lebih dari
2). Dimana ion Cu2+ (dari pereaksi biuret) dalam suasana basa akan
bereaksi dengan polipeptida yang menyusun protein dan membentuk senyawa
kompleks berwarna biru hingga ungu.
Dari
data hasil percobaan diatas dapat disimpulkan bahwa yang positif terhadap uji
ninhidrin adalah MSG, aspartam dan susu skim. Sedangkan yang negatif terhadap
uji ninhidrin ini adalah gelatin. Sedangkan sampel yang positif terhadap uji
biuret adalah gelatin dan susu skim dan yang negatif terhadap uji ini adalah
MSG dan aspartam.
DAFTAR PUSTAKA
Darjanto, S. U.
2008. Ilmu Kimia Organik. Fakultas
Pertanian dan Peternakan. Purwokerto: UNSOED
Eades, Michael R.
& Mary Dan Eades. 2010. Protein Power.
New York: New York University Press
Hawab, H.M. 2006. Pengantar Biokimia. Jakarta: Bayu Media
Publishing
Kristianti,
Elizabeth. 2010. Petunjuk Praktikum Kimia.
Salatiga: UKSW
Lesk. M., Arthur.
2013. Introduction to Protein
Architecture. New York: The Wall Street Journal
Lowery, Lonnie
Michael & Jose Antonio. 2012. Dietary
Protein and Resistance Exercise. Boston:CRC
Press
Ngili, Yohanes.
2009. Biokimia Struktur dan Fungsi
Biomolekul. Yogyakarta: Graha Ilmu
DAFTAR PUSTAKA TAMBAHAN
Buckle, K.A.
2007. Ilmu Pangan. Jakarta:
Universitas Indonesia Press
Pazos, Florencio
& Monica Chagoyen. 2015. Practical
Protein Bioinformatics. New York: The Wall
Street Journal
Purba, Michael.
2007. Kimia Jilid 3. Jakarta:
Erlangga
Sudaryani, T.
2006. Kualitas Telur. Jakarta:
Penebar Swadaya
No comments:
Post a Comment